AI设计+连续进化：刘如谦团队开辟蛋白酶工程新范式

AI驱动的蛋白质重新设计，为定向进化提供更优起点

华裔科学家、哈佛大学教授刘如谦（David R. Liu）团队在最新研究中提出一种新型蛋白质工程策略：先利用人工智能进行序列重设计以提升蛋白稳定性与表达水平，再以此为基础开展实验室连续进化，从而高效获得针对非天然靶点、兼具高催化效率与高特异性的新型蛋白酶。 该策略突破了传统定向进化依赖天然酶作为起点的局限——天然酶往往稳定性差、表达量低、可进化空间受限；而经AI重设计后的蛋白酶不仅保留原有功能，还展现出更强的进化潜力与功能拓展能力。

两步工作流：先稳后进，重塑进化逻辑

整个流程分为两个核心阶段： 第一阶段是计算设计。团队以肉毒杆菌神经毒素E型蛋白酶（BoNT/E）为模型，采用AI蛋白质设计模型ProteinMPNN对其氨基酸序列进行系统性重设计。设计原则是在保留底物识别与催化关键残基的前提下，由AI优化其余位点，并借助AlphaFold2预测结构可靠性。实验验证表明，多个AI设计变体（如D1、D2、D3）不仅能有效切割天然底物SNAP25，其中最优变体的催化效率达野生型的2.8倍。为进一步验证方法普适性，团队还使用另一设计工具PROSS对BoNT/E重设计，同样获得表达与稳定性显著提升的变体；并将该流程延伸至BoNT/F和BoNT/X，均实现功能保持或增强。 第二阶段是噬菌体辅助连续进化（PACE）。研究人员将AI设计变体D3与野生型BoNT/E分别作为起点，同步开展针对三种难度递增的新底物（415、413、412）的PACE筛选。结果明确显示：AI设计起点在所有底物上均更快、更稳定地获得高活性进化变体；尤其在最难底物412上，D3四组实验全部成功，而野生型仅两组成功；其进化回路激活强度达野生型变体的约2倍。突变互换实验证实，部分关键有益突变仅在AI设计背景下起效，无法直接移植到野生酶中，说明AI重设计已实质性改变了蛋白的进化轨迹与功能容错边界。

四大实证优势：从修复缺陷到拓展能力

该策略展现出四方面突出成效： 其一，修复已有进化蛋白酶的缺陷。此前通过PACE获得的PTEN切割变体E(4130)A2存在表达量低、热稳定性差等问题。研究人员将该变体的关键突变整合至AI设计变体D1/D2/D3中，新构建的融合蛋白不仅完全保留PTEN切割能力，且彻底丧失对SNAP25的切割活性。在大肠杆菌中，表达量提升2.2–5.2倍；在HEK293T细胞中，D2与D3表达量跃升超24倍，对应PTEN切割产物分别增加4.5倍与3.9倍。 其二，显著提升新底物进化效率。在相同PACE条件下，D3起点比野生型更易筛选出高活性变体，尤其在难切割底物上优势明显。这表明AI预优化并非简单“加固外壳”，而是从根本上拓宽了蛋白的功能探索维度。 其三，拓展蛋白酶的进化空间。以底物413为例，D3在进化过程中富集了野生型中罕见的突变组合，证明AI重设计使蛋白进入不同的序列-功能映射区域。团队进一步测试了其他AI设计变体（D4、PROSS1）作为起点，均能成功完成新底物进化，且各自产生独特基因型谱系，说明该策略具有良好的模块化与可扩展性。 其四，加速获得治疗相关靶向酶。团队将目标锁定神经退行疾病相关蛋白ataxin-2，选取其1181–1201片段作为新切割位点。相比从野生酶出发的进化路径，D3起点产生的变体切割ataxin-2速率提高1.4–1.7倍，且完全不识别SNAP25；在细胞实验中，其表达量更高、切割产物更多、副反应更少，展现出清晰的治疗工具酶潜力。

理性认知：当前边界与未来方向

研究团队坦率指出，该方法虽具广泛启发意义，但现阶段仍存在明确适用边界： 首先，当前验证集中于BoNT系列蛋白酶，这类蛋白具备较明确的催化结构域与可工程化底物识别区，且其功能易于在PACE系统中被耦合为选择压力。其他类型酶或功能蛋白是否适用，尚需跨体系验证。 其次，ataxin-2靶向变体目前仅完成体外与细胞水平验证，尚未进入动物模型或病理表型干预阶段。其真正转化为神经退行性疾病干预手段，还需深入评估蛋白降解动力学、包涵体清除效果及长期安全性。 最后，对于任何重新编程的蛋白酶，脱靶风险始终是临床转化的核心关切。未来工作需系统开展全蛋白组范围的切割谱分析、免疫原性评估、体内分布与清除动力学研究，并配套开发可控递送与开关调控机制，方能迈向实际应用。

范式迁移：从‘模仿自然’到‘重写规则’

这项研究标志着蛋白质工程正经历一次方法论跃迁：不再将天然序列视为不可更改的起点，而是将其作为初始输入，交由AI生成更优“进化前体”；再借力自动化连续进化，在可控环境中释放其潜在功能多样性。这种‘AI设计先行、实验进化跟进’的双轨范式，有望成为开发新型治疗酶、工业催化剂及合成生物学元件的通用路径。